科研动态二
视网膜色素变性治疗技术现状及进展
　　视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一类以进行性感光细胞和色素上皮细胞功能障碍为特征的遗传性疾病,世界范围内发病率为1/3000-1/4500.目前全世界约有数百万患者,为西方国家最常见的致盲性眼病之一,在我国,发现率呈逐年上升趋势.
　　RP单发于眼部,遗传类型多样.其中,常染色体隐性(autosomal reccssive,AR)遗传约占60%,常染色体显性(autosomal dominant,AD)遗传约占60%,常染色体显性(autosomal dominant,AD)遗传约占10%-25%,x-连锁遗传占5%-18%.此外,还有一些散发的RP,各型间又有一些亚型.虽RP有多种基因型,但其表型相似:早期为夜盲和周边视野进行性丧失,随后丧失色觉,最后致盲.多年来,许多研究着重于其发病机制和治疗研究,并逐渐形成了对RP治疗的方法体系.现就近年来RP治疗技术现状及主要进展作一介绍.
一、视网膜移植治疗RP
　　视网膜移植包括视网膜组织片移植和细胞移植两种。眼组织片移植始于1873年。但时隔近一个世纪后，第1例视网膜移植术才于1959年由Royo报道。确切而言，视网膜移植术的发展始于20世纪80年代中叶。1985年del Cerro等成功地将胚胎大鼠视网膜移植于成年大鼠前房内。近十年来，视网膜移植技术日趋完善。
（一）研究对象的选择
　　1、供体选择 主要是小鼠，大鼠，兔，猴及人等。其中，小鼠供龄为胎龄10天至生后3天，大鼠供龄为胎龄13天至生后5天；兔供龄为胎龄15天至生后5天；人类胚胎供龄为胚胎3-7天。移植物来源主要有：a,视网膜神经元细胞；b,视网膜组织片等。
　　2、受体选择 目前研究主要选择小鼠、大鼠、兔、猴、部分已用于人体。
　　3、候选疾病 目前主要针对各种原发和继发性视网膜色素变性（RP）。
（二）常见用于RP治疗的视网膜移植类型
　　1、感光细胞移植 感光细胞来源于胚胎和成人眼。用于移植的材料形式可以是游离细胞悬液，片层组织颗粒和感光细胞片层。游离细胞悬液是用酶消化法得到，即将视网膜在无Ca2+的Hanks液中洗涤，使视网膜神经上皮层与RPE层分离，再用酶消化神经上皮，得到感光细胞片层。1988年Towens-Anderson等首次用酶分离法获得视杆细胞，并使其维持功能24小时。Del Cerro等报道用胰蛋白酶消化获得感光细胞。Couras等用木瓜酶裂解消化获得良好视细胞，移植后可见发育良好的视细胞外节段。但细胞悬液破坏了感光细胞层正常的组织结构和细胞极性。改进方法是将视网膜组织制成颗粒，目前认为次法可减少对细胞结构和极性排列的影响。用机械切削或准分子激光切削制备感光细胞片层是目前视网膜移植研究的一个热点，相关研究认为此法不破坏感光细胞的原始排列和细胞极性，利于移植物解剖和功能构建。
　　2、色素上皮细胞移植眼色素上皮细胞包括视网膜色素上皮(RPE)和虹膜色素上皮（IPE）。目前以RPE移植治疗RP报道多见，而IPE相关研究报道少见。
　　a,RPE细胞移植：常规RPE移植术，即将RPE注入感光细胞和宿主RPE之间。常用两种方法：上径路法（外径路法）和前径路法（内径路法）。上径路是在病变网膜相应的巩膜面上将RPE悬液直接注入病变区的侧缘；前径路法则是用一玻璃套管通过睫状体平部后，再通过一视网膜孔，用喷射液先将病变的RPE冲洗后再注入新的RPE.
　　酶解Bruch's膜RPE移植术是一项新技术。Gouras等首先报道将人RPE经处理后直接注射于猴的Bruch膜上的方法。具体是：行眼球表麻后，沿角膜缘行250度环切，暴露前房，去除晶状体和玻璃体，视网膜上烧灼一个0.5mm平方创面,三边切割作一创瓣,暴露下方Bruch's膜,滴数滴无Ca2+和Mg2+但含EDTA 和胰酶的Hanks培养液于膜上,消化30分钟后,吸取病变的RPE.然后再注入培养的RPE.结果发现:术后2小时内,移植的RPE可与宿主Bruch膜粘合,形成一层类上皮样细胞层.病理检查发现被移植的RPE细胞形态及功能均同于正常的RPE,说明这一方法的可能性.
　　b,虹膜色素上皮细胞(IPE)移植:目前IPE移植主要用于治疗年龄相关型黄斑变性,单纯用于RP的研究报道尚未见.IPE与RPE具有组织同源性,其形态和结构与RPE非常相似,很多生理功能也一致.研究发现IPE对多种细胞因子的表达似于RPE,其对某些蛋白质清除功能与RPE一致,其能表达生长黑色素的基因,具有色素上皮细胞的性质,具有部分吞噬和降解感光细胞外节段(POS)的能力.鉴于 RP同时伴有感光细胞和色素上皮的异常,应用IPE联合感光细胞移植治疗RP将是未来的一个研究热点.
二、转基因技术治疗RP
　　基因治疗系指利用DNA重组和基因转移技术，在基因水平对疾病进行治疗的一类方法。基因治疗的原理包括：a,纠正由于DNA编码信息异常所致的基因产物缺失或功能障碍；
　　b、赋予某些细胞以新的功能或增强其原有的某些功能，从而改变疾病过程；
　　c、阻断某些细胞导致疾病的功能，从而消除或减轻疾病。
　　RP具有典型的遗传异质性，目前已分离出的RP致病基因有数十个，并且亦将多个RP致病基因定位到染色体的不同区域，其中对其致病机制较清楚的有三个：视紫红质（rhodopsin)基因，磷酸二酯酶亚基（PDE)基因，盘膜边缘蛋白（peripherin）基因。随着基因连锁分析技术等使用，并由此展开了对RP实施基因治疗的尝试。
（一）不同类型RP实施基因治疗的基本策略
　　1、常染色体显性（AD)RP的基因治疗 视紫红质基因和盘膜边缘蛋白基因突变产生了功能异常的蛋白从而导致ADRP形成，用单纯的替代无法阻止疾病的发展。最新的进展是导入核酶（ribozyine)治疗ADRP。它是一种中型RNA分子，可以识别特异性片断并产生裂解催化作用，清除异常基因。将核酶应用于一种转基因鼠中（成熟的视紫红质发生了组氨酸替代脯氨酸的基因突变），可不同程度地延缓感光细胞变性发展。
　　2、常染色体隐性（AR)RP的基因治疗PDE基因的缺陷导致了ARRP的形成，通过补充外源性基因可以替代缺失的基因，故较适宜进行基因治疗。PDE基因片断为2-3kb，能够为一般的载体所携带，便于广泛应用。
（二）基因治疗常用途径和选用载体
　　1、基因治疗常用途径 眼内基因治疗有两种途径：a,体内途径也称直接途径，是指将重组的外源基因直接注入眼内，在眼内直接表达出所需要的功能蛋白，从而发挥作用。注入眼内的部位主要有两个：玻璃体腔（主要用于神经节细胞的转染）和视网膜下腔（主要用于感光细胞和RPE的转染）。b、体外途径也称间接途径，则是将经过转基因后的靶细胞移植到眼内，使外源性基因得以表达。
　　2、RP基因治疗常用载体 病毒是目前所能得到的最为高效的体内载体。根据基因转移所用载体不同分为病毒载体非病毒载体两类。
　　a、病毒载体：病毒载体是指能够携带目的基因的复制缺陷病毒，常用的见于下列几种：
　　单纯疱疹病毒（HVS_1)载体：HSV能有效地转染分裂期后的神经元，它的终生转染，主动转录，神经元内潜伏等待性使它适宜于神经元或视网膜内的基因转染。HVS-1可以携带高达30kb的基因片断，同时可制备成浓度（1010pfu）载体，能够满足眼内应用的需要，故在将目的基因导入光感受器方面具有较好的应用前景。此外，HSV-1自身具有的免疫逃避（Immunity Evasion)机制使得体内对其难以发生免疫反应。目前认为HSV-1载体尤适于ARRP的基因治疗。
腺病毒（AV）载体：AV易于培养和纯化，可转染则增值期和非增值期细胞，具有高转染性。对于各类眼组织细胞均具有良好的亲和性，但其对发育成熟的视锥和视杆细胞亲和性较低，要提高其对感光细胞的转化效率，只能通过提高AV浓度实现。在成年鼠，理想的浓度为107pfu。当浓度超过108pfu时，将会产生毒副作用。由于其不能整合进染色体，属暂时表达，且含较多的腺病毒序列，可能刺激产生AV介导的免疫反应使得表达持续时间大多不超过3-4周，要延长表达时间只有采用重组AV 载体，如EAMs腺病毒重组载体。
　　腺相关病毒载体（AAV):AAV是一种无病理作用，定向整合到染色体的病毒载体，可以转染增值和非增值细胞，获得高效和长期表达。其对感光细胞和RPE均有很高的转化率，而且病毒的整合相对比较稳定，目的基因表达可以维持很长时间，不致病。重组AAV(rAAV )解决了以往载体浓度低，且必须腺病毒辅助制造的不足，外源性基因表达持续时间达18个月。在成年动物其转染感光细胞的效率可较AV载体高出2000倍。但其不足是携带的DNA片断短（最多达4.8kb),rAAV整合速度慢,易出现整合工程中的基因突变等.
　　慢病毒载体:慢病毒属于逆转录病毒家族,能同时感染分裂和非分裂细胞.以人类免疫缺陷病毒(HIV)为代表.HIV对感光细胞有高效和稳定的转染能力.研究发现用HIV-1携带PDE注入小鼠视网膜下腔,注入后第24周时,超过1/3的视网膜外核层可观察到1-3层的细胞,而对照组早在第六周时视网膜几乎完全变性.但由于HIV的致病性难于控制,用于人体的安全性有待进一步的研究.
　　逆转录病毒(RV)载体:其可以将目的的基因整合到染色体上,可以实现稳定长期表达,而且转移效率高,但其不能转染非增值期细胞,故难以用于角膜内皮细胞和成熟视网膜组织的基因转染.其可能产生整合突变.
　　b、非病毒载体：目前常用的非病毒载体方法主要有脂质体导法和受体介导法等。与病毒载体相比，其具有无致癌性，无病毒感染等优点，但缺点是整合效率很低。
　　脂质体载体：除上述共性特点之外，脂质体还具有安全，方便的特点，是一种很有前途的目的基因运转系统。通过研究已经使得脂质体转染效率明显提高，如脂质体转染试剂Lipofectin及其新一代产品Lipofectimine均具有较高的转染效率。Hangai等用特殊的脂质体转染系统对视网膜感光细胞层取得了较好的转染效果，但基因表达时间较AV载体短。
　　受体载体：受体载体介导法具有组织特异性导入的特点。Ohtake等用自杀基因通过EGF受体有效转染眼黑色素瘤细胞，在用相关药物后引起明显的细胞毒作用。相关研究还发现用受体介导法转染视网膜组织可以取得较好的效果。
（三）RP实施基因治疗常用技术
　　1、基因增补技术 基因增补技术就是不改变致病基因本身，而是导入有功能的目的基因，通过其表达来补偿缺陷基因的功能，其是目前最常用的基因治疗技术。该技术最适合于ARRP,因为只要导入缺陷基因的一个正常的拷贝基因就可以发挥补偿作用。视杆细胞磷酸二酯酶亚单位（PDE)基因的无意义突变是ARRP常见病因，它可使cGMP-PDE蛋白分子变短，酶活性下降，导致cGMP在感光细胞内积聚和视网膜变性的发生。Takahashi等发现将正常PDE基因导入rd 小鼠感光细胞后，可使感光细胞的酶活性和细胞功能恢复正常。
　　2、反义治疗技术 该技术也称基因失活技术，是利用反义核酸和/或核酶特异性的阻断突变基因的表达。此技术主要应用于ADRP,其原理是通过反义技术把异常基因删除或封闭其表达，同时保持正常野生型蛋白质的功能。目前核酶在ADRP的基因治疗研究中应用广泛。Drenser等用设计的核酶特异地切割P23H和S334Ter显性突变基因的转录物，能使视杆细胞中异常视紫红质蛋白含量明显降低。O'Neill分别构建了针对人视紫红质和盘膜边缘蛋白突变基因的mRNA核酶Rz10,Rz40MM等，可用于对相应ADRP的基因治疗。
　　3、抑制凋亡技术 细胞凋亡目前被公认是RP中感光细胞破坏得最主要机制。通过抑制感光细胞凋亡可延缓RP的发生。Bel-2家族是应用广泛的一种抑制凋亡的基因，已被证实可以阻断感光细胞的凋亡而促进细胞的存活。Tsang等通过转基因技术将凋亡基因bel-2导入Pdegtml/Pdegtml小鼠中，发现能延缓感光细胞变性的发生。Bennett等发现bel-2基因如与正常的野生型PDE基因共同导入发生PDE亚单位基因突变的rd/rd鼠中，可明显提高感光细胞的存活率。Xu等研究发现Caspase3抑制物即x染色体连锁凋亡抑制蛋白（X-linked IAP)在抗凋亡中的作用也为RP的防治提供了途径。
　　4、生长因子的基因治疗技术 视网膜下腔或玻璃体内注入细胞生长因子或神经营养因子均能延缓感光细胞变性的形成，所以，导入编码这些因子的基因将是一种可行的方法。Cayouette等将 AV携带的睫状神经营养因子（eiliary neurotrophic factor,CNTF)cDNA分别导入rd/rds鼠感光细胞中，发现可阻止视网膜变性中杆细胞的丢失，且暗示ERG波幅有明显提高，提示治疗后感光细胞功能有明显提高。研究发现，多种视网膜细胞具有编码bFGF mRNA的功能，视网膜组织缺乏bFGF,可引起顺行性营养性神经细胞坏死。Akimoto等用腺病毒将bFGF基因导入RCS大鼠杆细胞中，发现可明显延长视杆细胞生存时限，这比将bFGF直接注入眼内发挥作用的时间长的多。
三、药物治疗RP的新进展
　　多年来，许多研究发现某些药物可延缓RP的进程，为实施RP的药物治疗提供了依据。特别是细胞因子作用的发现，更为临床带来了希望。
（一）维生素A,牛磺酸和DHA对RP的防治作用
　　维生素A，牛磺酸和DHA是目前用于干预RP异常生化代谢最常用的物质，其共性为：视网膜内含量高，参与RPE和感光细胞正常结构和功能维持及正常光电转化反应。
　　1、维生素A对RP的防治作用 在视网膜中，维生素A通过衍生物视黄醛与视蛋白结合形成视紫红质，参与光电转化反应，产生视觉冲动。维生素A缺乏时首先引起视杆细胞敏感度下降，并最终出现视杆和视锥细胞外节盘膜丢失。该过程与RP病程相似，故认为RP形成可能与维生素A缺乏有关。Maw等对一ARRP家系研究发现：编码细胞内脱氢视黄醛结合蛋白的基因发生变异时会导致11——顺——视黄醇和11——顺——脱氢视黄醛不能有效被转运，从而引起局部维生素A代谢异常，而这可能与RP形成有关。
　　Noell和Williams等先后发现造成视网膜光损伤的光谱与视紫红质异常可能是引起视网膜损伤的启动因素，即视紫红质分解产生的游离视蛋白可激活光传导过程，并最终导致视杆和视锥细胞的死亡。当人体缺乏维生素A时，游离视蛋白含量的增加会持续激活光传导过程，导致光感受器的各种异常。
　　Berson等对一组年龄在18-49岁，不同性别及不同遗传型的RP病人进行维生素A治疗后发现：a,治疗组（15000IU/日）视网膜功能减退速度明显低于对照组（服用400IU/日维生素E);b,服用大剂量维生素A组（15000IU/日）视网膜功能明显优于低剂量维生素A组（75IU/日）。Sandberg等对T17M鼠（一种视蛋白基因变异鼠）模型试用大剂量（VitA102.5mg/kg)治疗后发现经治后暗适应ERG和全视野ERGa波、b波振幅下降幅度延缓，感光细胞内外节均延长，并由此提出大剂量维生素A可延缓RP病程进展。
　　2、牛磺酸对RP的防治作用 牛磺酸是一种氨基硫酸盐，主要通过食物从外界摄取，在视网膜中含量极为丰富，集中分布于RPE及感光细胞层。感光细胞中的牛磺酸主要通过视网膜特异性牛磺酸结合蛋白（载体蛋白）从细胞外转运。牛磺酸对视网膜发育、正常结构与功能维持有重要作用。研究发现牛磺酸可保护受氧化或光照刺激的视网膜结构免受破坏。它还是感光细胞标记物，当视网膜大部分感光细胞发生变性后，仅残存感光细胞中有牛磺酸的存在，提示牛磺酸具有促进感光细胞存活的作用。在X染色体性连锁RP和部分散发RP患者血浆中牛磺酸水平均呈不同程度的降低。
　　研究发现部分RP患者血小板对牛磺酸摄取能力降低，血小板内源性牛磺酸含量下降。部分RP病人淋巴母细胞对牛磺酸摄取率显著降低。但也有研究发现大部分RP患者血浆中牛磺酸水平正常，提示其变化具有遗传异质性。相关研究发现摄入无牛磺酸饮食的动物及儿童，因菌群失调导致牛磺酸被细菌大量消耗的病人都会出现ERG异常及感光细胞变性，而补充牛磺酸则可逆转或预防该现象的发生。Berson等分别用添加牛磺酸和牛磺酸前体（酪蛋白）饲料喂养猫，发现只有摄入添加牛磺酸饲料的猫才能维持视网膜功能及ERG的正常。但对RP病人进行的治疗实验并未发现类似现象。
　　3、二十二碳六烯酸（DHA）对RP的防治作用 DHA是含有22个碳的长链不饱和脂肪酸，有6个双链，是人体内不饱和程度最高的脂肪酸之一。其前体物碳三烯酸（亚麻酸）在体内不能合成，需从食物中摄取。视网膜中DHA来源主要有3个：原位合成，食物中直接获取和在肝脏中由其他脂类合成。任何一种途径的异常均可导致视网膜内DHA含量异常。
　　DHA具有的高度不饱和性直接影响生物膜的流动性，进而影响一些蛋白质活性，生物信号传递及受体功能。DHA还具有改变细胞膜曲率、影响膜的可压缩性、破坏膜表面的氢键等作用。在视网膜内，感光细胞外节盘膜磷脂类物质中DHA含量较其他组织高45%-60%，这与视紫红质在光传导中发挥正常作用有关。目前认为视紫红质在外节盘膜中循环代谢过程受膜流动性的影响。
　　DAN可调节神经递质释放，摄取及cCMP的代谢。它不但能延缓感光细胞凋亡，还能使发生凋亡的细胞数量降低。在一些RP患者及RP动物模型体内均发现有不饱和脂肪酸的代谢异常。Wetzel等发现：RP模型pred犬感光细胞外节盘膜的更新率仅为正常组的35%-45%，血中DHA含量与正常对照有显著差异。ADRP、XL-RP、ARRP及Usher's综合症患者红细胞内及血浆中DHA水平明显降低，且其下降幅度与病变严重程度成正比。同时发现DHA合成过程的中间产物水平有不同程度的升高，提示在DHA合成的不同阶段存在着不同的异常变化。但RP病人体内DHA水平变化并不恒定，提示DHA水平的改变具有遗传异质性。
　　研究发现，在多种不饱和脂肪酸中，不饱和脂肪酸对视网膜发育及功能有重要作用。用不含脂肪酸饲料喂养的动物可出现ERGa波及b波的异常。Birch等分别用不同浓度不饱和脂肪酸喂养低体重儿，发现低浓度组视杆细胞ERG值较高，b波最大峰值较低。用添加DHA的食物喂养健康早产儿（体重1500g）38周后发现其VEP敏感度明显提高。
（二）神经营养因子对RP中感光细胞凋亡的神经保护作用
　　由于各型RP的最终途径均是感光细胞凋亡，通过干预细胞凋亡过程，就有可能缓解病程进展。神经营养因子（neurotrophic factor,NF）存在于神经组织内，对神经元生存，发育和凋亡有重要调节作用。现已发现眼组织中存在的NF有：CNTF,FGF,TGF,PDGF等，他们主要由RPE及Muller细胞产生，存在于感光细胞外基质（EPM）中，浓度虽低但活性强大。
　　研究发现：局部视网膜受到急性损伤或持续光照射后，受损区附近及更远处感光细胞活性反而增强，该部位bFGF、CNTF含量升高，提示视网膜受刺激后，可应激产生细胞因子以挽救和促进感光细胞生存。Xiao等发现在rd鼠，RCS鼠及rdy猫模型中，视网膜下腔注射bFGF、CNTF及其类似物（Axokine),BDNF,CDNF等，均能延缓感光细胞凋亡，但作用持续时间不同。其中，bFGF不仅直接对感光细胞和RPE有营养及促分化作用，而且其他营养因子如BDNF,CNTF也通过其发挥作用。但有关此方面研究仅限动物实验阶段。
（三）钙离子拮抗剂对RP过程中光电转化过程异常的干预作用
　　rd鼠是由于编码视杆细胞eGMP磷酸二酯酶亚单位的基因突变，cGMP无法有效水解，局部浓度过高而引发细胞变性。已知感光细胞内产生光敏性生物电流的阳离子通道受eGMP门控。正常生理条件下，开放的cGMP门控阳离子通道数量很少（持续光照时几乎全部关闭，暗环境下仅有1%—5%开放），因此通过通道进入细胞内的Ca2+量极少。cCMP浓度增加时，该通道对Ca2+选择同透性增高，同时也激活感光细胞上L——型Ca2+大量涌入胞质。
　　研究发现，将细胞内线粒体暴露在高Ca2+环境下，其氧耗量及ATP产生量减少。这是导致感光细胞发生变性的原因之一。用Ca2+拮抗剂阻断Ca2+经过上述通道进入细胞，从而减少细胞内的Ca2+，有可能成为治疗eGMP_PDE亚单位突变所致RP的一种途径。Frasson等发现向已经发生感光细胞变性的rd鼠腹腔内反复注射L-顺—Diltiazem（20——60mg/kg),可使视网膜内残存感光细胞数量明显，ERG中a,b波振幅均高于对照组，证明L_Cis_Diltiazem可以延缓rd鼠感光细胞变性的发展。但钙拮抗剂用于RP治疗的安全剂量如何确定，长期应用是否会对机体产生不良后果，均待进一步研究。